Eines der wichtigsten molekulargenetischen Verfahren in der Forschung ist die Vervielf\u00e4ltigung von DNA-Abschnitten. Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) ist es m\u00f6glich, unbegrenzt viele Kopien eines vorliegenden DNA-Abschnittes herzustellen. Dies ist h\u00e4ufig n\u00f6tig, da oft nur eine kleine Menge der DNA vorliegt, mit der weiter gearbeitet oder geforscht werden soll. Die Methode der PCR \u00e4hnelt in vielen Schritten der nat\u00fcrlichen DNA-Replikation.<\/p>\n
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F\u00fcr die Polymerase-Kettenreaktion wird ben\u00f6tigt:<\/strong><\/p>\n
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den zu vervielf\u00e4ltigen DNA-Abschnitt<\/li>\n
Nukleotide (dNTPS)<\/li>\n
hitzestabile DNA-Polymerasen<\/li>\n
zwei DNA-Primer<\/li>\n<\/ul>\n
Der Vorgang l\u00e4sst sich in drei Schritte unterteilen:<\/strong><\/p>\n\n
Denaturierung<\/li>\n
Hybridisierung<\/li>\n
Elongation<\/li>\n<\/ol>\n<\/div>\n\n
Bei der Denaturierung wird der DNA-Strang oder DNA-Abschnitt auf ungef\u00e4hr 95\u25e6C erhitzt. Dadurch werden die Wasserstoffbr\u00fcckenbindungen aufgel\u00f6st, sodass zwei DNA-Einzelstr\u00e4nge entstehen.<\/p>\n
Bei der Hybridisierung wird die Temperatur des Ganzen wieder auf 50 bis 70\u25e6C abgek\u00fchlt. Bei diesen Temperaturen lagern sich die DNA-Primer, die komplement\u00e4r zu den 3\u2019-Enden der Einzelstr\u00e4nge sind, an die DNA an und bilden so die Startpunkte f\u00fcr die DNA-Polymerase.<\/p>\n
Bei dem dritten Schritt, der Elongation, erhitzt man das Gemisch erneut auf ungef\u00e4hr 72\u25e6C. Bei dieser Temperatur lagern sich die hitzebest\u00e4ndigen DNAPolymerasen an die Primer und synthetisieren ausgehend vom 3\u2019-Ende die komplement\u00e4ren DNA-Str\u00e4nge. Dadurch entstehen aus einem urspr\u00fcnglichen, doppelstr\u00e4ngigen DNA-Strang zwei identische doppelstr\u00e4ngige DNA-Abschnitte.<\/p>\n
Der Zyklus der PCR beginnt nach diesem letzten Schritt erneut. Bei jedem Durchgang verdoppelt sich dadurch die Anzahl der DNA-Abschnitte, es findet also eine exponentielle Vermehrung statt. Die DNA-Polymerase, die bei der PCR verwendet wird, stammt aus dem Bakterium Thermus aquaticus. Hierbei handelt es sich um ein Tiefseebakterium aus hei\u00dfen Quellen, weshalb die Polymerase sehr hitzebest\u00e4ndig ist.<\/p>\n
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Genetischer Fingerabdruck<\/h2>\n
Die Analyse des Restriktionsfragment-L\u00e4ngenpolymorphismus (RFLP) ist eine Methode zur Gendiagnose beim Menschen. Dieses Verfahren beruht darauf, dass dieselben Restriktionsenzyme die DNA einer Person immer in gleichlange Fragmente schneiden, da die Restriktionsenzyme bestimmte Erkennungssequenzen besitzen. Zwei verschiedene Menschen haben im Normalfall unterschiedliche Basenfolgen, weshalb die DNA-Fragmente bei zwei Personen nie identisch lang sind. Das DNA-Fragmentl\u00e4ngen-Bandmuster, was aus diesen Abschnitten entsteht, ist ein unverwechselbares und charakteristisches Merkmal einer Person. Besonders eignen sich f\u00fcr diese Untersuchung die sogenannten polymorphen Bereiche eines Genoms. Hierbei handelt es sich um die Abschnitte der DNA, die keine genetischen Informationen enthalten. Daher bleiben in diesen Bereichen kleiner Mutationen ohne Folge, werden nicht ausselektiert und bleiben deshalb erhalten. Diese polymorphen Bereiche unterscheiden sich sehr stark von Mensch zu Mensch und eignen sich daher besonders f\u00fcr die RFLP-Methode.<\/p>\n
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Vorgehen der RFLP-Methode:<\/strong><\/p>\n\n
DNA wird aus Zellen der Mundschleimhaut, des Blutes oder aus anderen Zellen isoliert.<\/li>\n
Mithilfe der PCR (siehe Kapitel 2.8.2) werden ausgew\u00e4hlte polymorphe Bereiche vervielf\u00e4ltigt, zur Absicherung werden drei verschiedene Abschnitte untersucht.<\/li>\n
Die polymorphen Bereiche werden mit bestimmten Restriktionsenzymen behandelt, woraufhin unterschiedlich lange Restriktionsfragmente entstehen.<\/li>\n
Das Gemisch wird in eine Gel-Elektrophorese gegeben. Dieses Ger\u00e4t sorgt durch elektrische Impulse daf\u00fcr, dass sich die DNA-Fragmente ihrer L\u00e4nge nach auftrennen und so ein charakteristisches Bandenmuster entsteht.<\/li>\n<\/ol>\n<\/div>\n
Schau dir zur Wiederholung dieses Lernvideo zur Polymerasen-Kettenreaktion<\/strong> \n
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